La fase mobile è equivalente alla fase liquida del sangue, e ci sono varie cose a cui prestare attenzione durante l'uso. Tra questi ci sono alcune “insidie” a cui bisogna prestare attenzione.
01. Misurare il pH della fase mobile dopo aver aggiunto il solvente organico
Se misuri il pH con un additivo organico, il pH che otterrai sarà diverso rispetto a prima dell'aggiunta del solvente organico. Tuttavia, la cosa più importante è essere coerenti. Se misuri sempre il pH dopo aver aggiunto il solvente organico, assicurati di indicare i passaggi del metodo che utilizzi in modo che altri seguano lo stesso metodo. Questo metodo non è accurato al 100%, ma almeno manterrà il metodo coerente. Questo potrebbe essere più importante che ottenere un valore pH accurato.
02. Nessun buffer utilizzato
Lo scopo di un tampone è controllare il pH e impedirne la variazione. Molti altri metodi modificano il pH della fase mobile, il che può causare cambiamenti nel tempo di ritenzione, nella forma e nella risposta del picco.
L'acido formico, il TFA, ecc. non sono tamponi
03. Non utilizzare il tampone nell'intervallo di pH normale
Ciascun tampone ha un intervallo di 2 unità di pH, all'interno del quale fornisce la migliore stabilità del pH. I tamponi al di fuori di questa finestra non forniranno una resistenza efficace alle variazioni di pH. Utilizza un tampone nell'intervallo corretto oppure scegli un tampone che copra l'intervallo di pH di cui hai bisogno.
04. Aggiungere il tampone alla soluzione organica
La miscelazione di una soluzione tampone con una fase organica molto probabilmente causerà la precipitazione del tampone. In molti casi, anche se si sono verificate precipitazioni, è ancora difficile rilevarle. Ricordarsi di aggiungere sempre la soluzione organica alla fase acquosa, il che può ridurre notevolmente la possibilità di precipitazione del tampone.
05. Miscelare il gradiente di concentrazione dallo 0% con una pompa
Le pompe oggi disponibili possono miscelare efficacemente le fasi mobili e degassare in linea, ma non tutti coloro che utilizzano il tuo metodo avranno una pompa di alta qualità. Mescola A e B in un'unica soluzione ed eseguila al 100% in linea.
Ad esempio, è possibile preparare 950 ml di miscela organica di partenza mescolando con 50 ml di acqua. Il vantaggio di ciò è che può ridurre la variabilità tra HPLC e ridurre la possibilità di bolle e precipitazioni nel sistema. Vale la pena notare che il rapporto della miscela della pompa è 95:5, il che non significa che anche il tempo di ritenzione della premiscelata nel flacone sia 95:5.
06. Non utilizzare l'acido modificato (base) corretto per cambiare il tampone
Utilizza solo l'acido o la base che forma il sale tampone che stai utilizzando. Ad esempio, un tampone fosfato di sodio deve essere preparato solo con acido fosforico o idrossido di sodio.
07. Non indicare tutte le informazioni sul tampone nel metodo, come aggiungere 5 g difosfato di sodio in 1000 ml di acqua.
Il tipo di tampone determina l'intervallo di pH che può essere tamponato. La concentrazione richiesta determina la forza del tampone. 5 grammi o fosfato di sodio anidro e 5 grammi di fosfato monosodico monoidrato hanno forze tampone diverse.
08. Aggiunta di solventi organici prima del controllo
Se il metodo precedente utilizzava una soluzione tampone per la linea di base B e il tuo metodo utilizza una soluzione organica per la linea di base B, puoi eventualmente depositare il tampone nel tubo della pompa e nella testa della pompa.
09. Sollevare la bottiglia e svuotare l'ultima goccia
C'è una buona probabilità che non avrai abbastanza fase mobile per completare l'intera analisi e il tuo campione fumerà. Oltre alla possibilità di bruciare il sistema di pompa e la colonna, la fase mobile evaporerà completamente e la fase mobile nella parte superiore della bottiglia cambierà.
10. Utilizzare la fase mobile con degasaggio ad ultrasuoni
Il punto più importante è assicurarsi che tutti i sali tampone siano disciolti, ma questo è il modo peggiore per degasare e riscalderà rapidamente la fase mobile, facendo evaporare i componenti organici. Per evitare inutili problemi in seguito, dedica cinque minuti al filtraggio sotto vuoto della fase mobile.
Orario di pubblicazione: 27 agosto 2024