La cromatografia liquida è il metodo principale per testare il contenuto di ciascun componente e le impurità nelle materie prime, nei prodotti intermedi, nei preparati e nei materiali di imballaggio, ma molte sostanze non dispongono di metodi standard su cui fare affidamento, quindi è inevitabile sviluppare nuovi metodi. Nello sviluppo di metodi in fase liquida, la colonna cromatografica è il nucleo della cromatografia liquida, quindi la scelta della colonna cromatografica adatta è fondamentale. In questo articolo, l'autore spiegherà come scegliere una colonna per cromatografia liquida basandosi su tre aspetti: idee generali, considerazioni e ambito di applicazione.
A. Idee generali per la selezione delle colonne per cromatografia liquida
1. Valutare le proprietà fisiche e chimiche dell'analita: come struttura chimica, solubilità, stabilità (ad esempio se è facile da ossidare/ridurre/idrolizzare), acidità e alcalinità, ecc., in particolare la struttura chimica è la chiave fattore nel determinare le proprietà, come il gruppo coniugato ha un forte assorbimento dell'ultravioletto e una forte fluorescenza;
2. Determinare lo scopo dell'analisi: se sono richiesti elevata separazione, elevata efficienza della colonna, breve tempo di analisi, elevata sensibilità, resistenza all'alta pressione, lunga durata della colonna, basso costo, ecc.;
- Scegliere una colonna cromatografica adatta: comprendere la composizione, le proprietà fisiche e chimiche del riempitivo cromatografico, come la dimensione delle particelle, la dimensione dei pori, la tolleranza alla temperatura, la tolleranza al pH, l'adsorbimento dell'analita, ecc.
- Considerazioni sulla scelta delle colonne per cromatografia liquida
In questo capitolo verranno discussi i fattori da considerare nella scelta di una colonna cromatografica dal punto di vista delle proprietà fisiche e chimiche della colonna cromatografica stessa. 2.1 Matrice di riempimento
2.1.1 Matrice di gel di silice La matrice di riempimento della maggior parte delle colonne per cromatografia liquida è il gel di silice. Questo tipo di riempitivo ha elevata purezza, basso costo, elevata resistenza meccanica ed è facile da modificare gruppi (come legame fenilico, legame amminico, legame ciano, ecc.), ma il valore di pH e l'intervallo di temperatura che tollera sono limitati: il L'intervallo di pH della maggior parte dei riempitivi a matrice di gel di silice è compreso tra 2 e 8, ma l'intervallo di pH delle fasi legate con gel di silice appositamente modificato può essere ampio da 1,5 a 10, e ci sono anche fasi legate con gel di silice appositamente modificate che sono stabili a pH basso, come Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, che è stabile a pH compreso tra 1 e 8; il limite di temperatura superiore della matrice di gel di silice è solitamente di 60 ℃ e alcune colonne cromatografiche possono tollerare una temperatura di 40 ℃ a pH elevato.
2.1.2 Matrice polimerica I riempitivi polimerici sono principalmente polistirene-divinilbenzene o polimetacrilato. I loro vantaggi sono che possono tollerare un ampio intervallo di pH – possono essere utilizzati nell’intervallo da 1 a 14, e sono più resistenti alle alte temperature (possono raggiungere oltre 80 °C). Rispetto ai riempitivi C18 a base di silice, questo tipo di riempitivo ha una maggiore idrofobicità e il polimero macroporoso è molto efficace nella separazione di campioni come le proteine. Gli svantaggi sono che l'efficienza della colonna è inferiore e la resistenza meccanica è inferiore rispetto a quella dei riempitivi a base di silice. 2.2 Forma delle particelle
La maggior parte dei moderni riempitivi HPLC sono particelle sferiche, ma a volte sono particelle irregolari. Le particelle sferiche possono fornire una pressione della colonna inferiore, una maggiore efficienza della colonna, stabilità e una maggiore durata; quando si utilizzano fasi mobili ad alta viscosità (come l'acido fosforico) o quando la soluzione campione è viscosa, le particelle irregolari hanno un'area superficiale specifica più ampia, che favorisce maggiormente la piena azione delle due fasi, e il prezzo è relativamente basso. 2.3 Dimensione delle particelle
Minore è la dimensione delle particelle, maggiore è l'efficienza della colonna e maggiore è la separazione, ma peggiore è la resistenza all'alta pressione. La colonna più comunemente utilizzata è la colonna con dimensione delle particelle di 5 μm; se i requisiti di separazione sono elevati, è possibile selezionare un riempitivo da 1,5-3 μm, che contribuisce a risolvere il problema della separazione di alcune matrici complesse e campioni multicomponente. UPLC può utilizzare riempitivi da 1,5 μm; Per le colonne semi-preparative o preparative vengono spesso utilizzati riempitivi con dimensioni delle particelle pari o superiori a 10 μm. 2.4 Contenuto di carbonio
Il contenuto di carbonio si riferisce alla proporzione della fase legata sulla superficie del gel di silice, che è correlata all'area superficiale specifica e alla copertura della fase legata. L'alto contenuto di carbonio fornisce un'elevata capacità della colonna e un'elevata risoluzione e viene spesso utilizzato per campioni complessi che richiedono un'elevata separazione, ma a causa del lungo tempo di interazione tra le due fasi, il tempo di analisi è lungo; Le colonne cromatografiche a basso contenuto di carbonio hanno un tempo di analisi più breve e possono mostrare selettività diverse e sono spesso utilizzate per campioni semplici che richiedono analisi rapide e campioni che richiedono condizioni di fase acquosa elevata. Generalmente, il contenuto di carbonio del C18 varia dal 7% al 19%. 2.5 Dimensione dei pori e area superficiale specifica
I mezzi di adsorbimento HPLC sono particelle porose e la maggior parte delle interazioni avviene nei pori. Pertanto, le molecole devono entrare nei pori per essere assorbite e separate.
La dimensione dei pori e l’area superficiale specifica sono due concetti complementari. Una piccola dimensione dei pori significa un'ampia superficie specifica e viceversa. Un'ampia area superficiale specifica può aumentare l'interazione tra le molecole del campione e le fasi legate, migliorare la ritenzione, aumentare il caricamento del campione, la capacità della colonna e la separazione dei componenti complessi. I riempitivi completamente porosi appartengono a questo tipo di riempitivi. Per chi ha elevate esigenze di separazione è consigliabile scegliere riempitivi con ampia superficie specifica; una piccola superficie specifica può ridurre la contropressione, migliorare l'efficienza della colonna e ridurre il tempo di equilibrio, il che è adatto per l'analisi del gradiente. A questa tipologia di riempitivi appartengono i riempitivi core-shell. Con la premessa di garantire la separazione, si consiglia di scegliere riempitivi con piccola superficie specifica per chi ha esigenze di elevata efficienza di analisi. 2.6 Volume dei pori e resistenza meccanica
Il volume dei pori, noto anche come “volume dei pori”, si riferisce alla dimensione del volume vuoto per particella unitaria. Può ben riflettere la resistenza meccanica del riempitivo. La resistenza meccanica dei riempitivi con grande volume dei pori è leggermente inferiore a quella dei riempitivi con piccolo volume dei pori. I riempitivi con volume dei pori inferiore o uguale a 1,5 mL/g vengono utilizzati principalmente per la separazione HPLC, mentre i riempitivi con volume dei pori superiore a 1,5 mL/g vengono utilizzati principalmente per la cromatografia ad esclusione molecolare e la cromatografia a bassa pressione. 2.7 Tasso di limitazione
Il capping può ridurre i picchi di coda causati dall'interazione tra composti e gruppi silanolici esposti (come legami ionici tra composti alcalini e gruppi silanolici, forze di van der Waals e legami idrogeno tra composti acidi e gruppi silanolici), migliorando così l'efficienza della colonna e la forma dei picchi . Le fasi legate non protette produrranno selettività diverse rispetto alle fasi legate non protette, in particolare per i campioni polari.
- Ambito di applicazione di diverse colonne per cromatografia liquida
Questo capitolo descriverà l'ambito di applicazione dei diversi tipi di colonne per cromatografia liquida attraverso alcuni casi.
3.1 Colonna cromatografica C18 a fase inversa
La colonna C18 è la colonna a fase inversa più comunemente utilizzata, in grado di soddisfare i test di contenuto e impurità della maggior parte delle sostanze organiche ed è applicabile a sostanze mediamente polari, debolmente polari e non polari. Il tipo e le specifiche della colonna cromatografica C18 devono essere selezionati in base ai requisiti di separazione specifici. Ad esempio, per le sostanze con elevati requisiti di separazione, vengono spesso utilizzate le specifiche 5 μm*4,6 mm*250 mm; per sostanze con matrici di separazione complesse e polarità simile, è possibile utilizzare le specifiche 4 μm*4,6 mm*250 mm o dimensioni delle particelle più piccole. Ad esempio, l'autore ha utilizzato una colonna da 3 μm*4,6 mm*250 mm per rilevare due impurità genotossiche nell'API celecoxib. La separazione delle due sostanze può raggiungere 2,9, un valore eccellente. Inoltre, con la premessa di garantire la separazione, se è richiesta un'analisi rapida, viene spesso selezionata una colonna corta da 10 mm o 15 mm. Ad esempio, quando l'autore ha utilizzato la LC-MS/MS per rilevare un'impurità genotossica nell'API piperachina fosfato, è stata utilizzata una colonna da 3 μm*2,1 mm*100 mm. La separazione tra l'impurezza e il componente principale era 2,0 e la rilevazione di un campione può essere completata in 5 minuti. 3.2 Colonna fenilica in fase inversa
La colonna di fenile è anche un tipo di colonna a fase inversa. Questo tipo di colonna ha una forte selettività per i composti aromatici. Se la risposta dei composti aromatici misurati dalla normale colonna C18 è debole, si può prendere in considerazione la sostituzione della colonna fenile. Ad esempio, quando stavo realizzando l'API celecoxib, la risposta del componente principale misurata dalla colonna di fenile dello stesso produttore e con le stesse specifiche (tutti 5 μm*4,6 mm*250 mm) era circa 7 volte quella della colonna C18. 3.3 Colonna a fase normale
Come efficace complemento alla colonna a fase inversa, la colonna a fase normale è adatta per composti altamente polari. Se il picco è ancora molto veloce quando si eluisce con più del 90% di fase acquosa nella colonna a fase inversa, e addirittura si avvicina e si sovrappone al picco del solvente, è possibile prendere in considerazione la sostituzione della colonna a fase normale. Questo tipo di colonna include colonna ilica, colonna amminica, colonna ciano, ecc.
3.3.1 Colonna hilica La colonna hilica solitamente incorpora gruppi idrofili nella catena alchilica legata per migliorare la risposta alle sostanze polari. Questo tipo di colonna è adatta per l'analisi di sostanze zuccherine. L'autore ha utilizzato questo tipo di colonna per descrivere il contenuto e le sostanze correlate dello xilosio e dei suoi derivati. Anche gli isomeri di un derivato dello xilosio possono essere ben separati;
3.3.2 Colonna amminica e colonna ciano Colonna amminica e colonna ciano si riferiscono all'introduzione di modifiche amminiche e ciano all'estremità della catena alchilica legata, rispettivamente, per migliorare la selettività per sostanze speciali: ad esempio, la colonna amminica è una buona scelta per la separazione di zuccheri, amminoacidi, basi e ammidi; La colonna ciano ha una migliore selettività quando separa sostanze simili strutturali idrogenate e non idrogenate grazie alla presenza di legami coniugati. La colonna Amino e la colonna ciano possono spesso essere scambiate tra colonna a fase normale e colonna a fase inversa, ma non è consigliabile un cambio frequente. 3.4 Colonna chirale
La colonna chirale, come suggerisce il nome, è adatta alla separazione e all'analisi di composti chirali, soprattutto in campo farmaceutico. Questo tipo di colonna può essere preso in considerazione quando le colonne convenzionali a fase inversa e a fase normale non riescono a ottenere la separazione degli isomeri. Ad esempio, l'autore ha utilizzato una colonna chirale da 5 μm*4,6 mm*250 mm per separare i due isomeri della 1,2-difeniletilendiammina: (1S, 2S)-1, 2-difeniletilendiammina e (1R, 2R)-1, 2 -difeniletilendiammina, e la separazione tra i due raggiunse circa 2,0. Tuttavia, le colonne chirali sono più costose rispetto ad altri tipi di colonne, solitamente 1W+/pezzo. Se sono necessarie tali colonne, l'unità deve disporre di un budget sufficiente. 3.5 Colonna a scambio ionico
Le colonne a scambio ionico sono adatte per la separazione e l'analisi di ioni carichi, come ioni, proteine, acidi nucleici e alcune sostanze zuccherine. A seconda del tipo di riempitivo, si dividono in colonne a scambio cationico, colonne a scambio anionico e colonne a scambio cationico forte.
Le colonne a scambio cationico includono colonne a base di calcio e a base di idrogeno, adatte principalmente per l'analisi di sostanze cationiche come gli amminoacidi. Ad esempio, l'autore ha utilizzato colonne a base di calcio durante l'analisi del gluconato di calcio e dell'acetato di calcio in una soluzione di lavaggio. Entrambe le sostanze hanno avuto risposte forti a λ=210 nm e il grado di separazione ha raggiunto 3,0; l'autore ha utilizzato colonne a base di idrogeno durante l'analisi delle sostanze correlate al glucosio. Diverse importanti sostanze correlate – maltosio, maltotriosio e fruttosio – presentavano un'elevata sensibilità con rilevatori differenziali, con un limite di rilevamento pari a 0,5 ppm e un grado di separazione di 2,0-2,5.
Le colonne a scambio anionico sono adatte principalmente per l'analisi di sostanze anioniche come acidi organici e ioni alogeno; Le colonne a scambio cationico forte hanno capacità e selettività di scambio ionico più elevate e sono adatte per la separazione e l'analisi di campioni complessi.
Quanto sopra è solo un'introduzione ai tipi e ai campi di applicazione di diverse comuni colonne per cromatografia liquida combinate con l'esperienza dell'autore. Esistono altri tipi speciali di colonne cromatografiche nelle applicazioni reali, come colonne cromatografiche a pori grandi, colonne cromatografiche a pori piccoli, colonne per cromatografia di affinità, colonne cromatografiche multimodali, colonne per cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UHPLC), colonne per cromatografia a fluido supercritico ( SFC), ecc. Svolgono un ruolo importante in diversi campi. Il tipo specifico di colonna cromatografica deve essere selezionato in base alla struttura e alle proprietà del campione, ai requisiti di separazione e ad altri scopi.
Orario di pubblicazione: 14 giugno 2024