Principi e metodi di analisi quantitativa mediante cromatografia liquida

Il meccanismo di separazione della cromatografia liquida si basa sulla differenza di affinità dei componenti della miscela per le due fasi.

Secondo le diverse fasi stazionarie, la cromatografia liquida è divisa in cromatografia liquido-solido, cromatografia liquido-liquido e cromatografia in fase legata.Le più utilizzate sono la cromatografia liquido-solido con gel di silice come riempitivo e la cromatografia in fase legata con microsilice come matrice.

Secondo la forma della fase stazionaria, la cromatografia liquida può essere suddivisa in cromatografia su colonna, cromatografia su carta e cromatografia su strato sottile.In base alla capacità di adsorbimento, può essere suddivisa in cromatografia di adsorbimento, cromatografia di partizione, cromatografia a scambio ionico e cromatografia a permeazione di gel.

Negli ultimi anni, un sistema di flusso di liquido ad alta pressione è stato aggiunto al sistema di cromatografia su colonna liquida per far scorrere rapidamente la fase mobile ad alta pressione per migliorare l'effetto di separazione, quindi cromatografia liquida ad alta efficienza (nota anche come alta pressione) è emerso.

PARTE
01 Principio dell'analisi quantitativa della cromatografia liquida

Per quantificare su base qualitativa sono necessarie sostanze pure come standard;

La quantificazione della cromatografia liquida è un metodo relativamente quantitativo: ovvero, la quantità dell'analita nella miscela viene stimata da una quantità nota di campione standard puro

PARTE
02 Base per la quantificazione mediante cromatografia liquida

La quantità del componente misurato (W) è proporzionale al valore di risposta (A) (altezza del picco o area del picco), W=f×A.

Fattore di correzione quantitativa (f): È la costante di proporzionalità della formula di calcolo quantitativo, e il suo significato fisico è la quantità della componente misurata rappresentata dal valore di risposta unitario (area di picco).

Il fattore di correzione quantitativo può essere ottenuto dalla quantità nota di campione standard e dal suo valore di risposta.

Misurare il valore di risposta del componente sconosciuto e la quantità del componente può essere ottenuta mediante il fattore di correzione quantitativa.

PARTE
03 Termini comuni nell'analisi quantitativa

Campione (campione): una soluzione contenente un analita per l'analisi cromatografica.Diviso in campioni standard e sconosciuti.

Standard: un prodotto puro con una concentrazione nota.Campione sconosciuto (sconosciuto): la miscela la cui concentrazione deve essere testata.

Peso del campione: la pesata originale del campione da testare.

Diluizione: il fattore di diluizione del campione sconosciuto.

Componente: il picco cromatografico da analizzare quantitativamente, cioè l'analita il cui contenuto non è noto.

Quantità del componente (quantità): il contenuto (o la concentrazione) della sostanza da testare.

Integerità: il processo computazionale di misurazione dell'area di un picco cromatografico da parte di un computer.

Curva di calibrazione: una curva lineare del contenuto del componente rispetto al valore di risposta, stabilita da una quantità nota di sostanza standard, utilizzata per determinare il contenuto sconosciuto dell'analita.

PARTE
04 Analisi quantitativa della cromatografia liquida

1. Selezionare un metodo cromatografico adatto per l'analisi quantitativa:

l Confermare il picco del componente rilevato e ottenere una risoluzione (R) superiore a 1,5

l Determinare la consistenza (purezza) dei picchi cromatografici dei componenti testati

l Determinare il limite di rilevamento e il limite di quantificazione del metodo;sensibilità e range lineare

2. Stabilire una curva di calibrazione con campioni standard di diverse concentrazioni

3. Controllare l'accuratezza e la precisione dei metodi quantitativi

4. Utilizzare il software di gestione della cromatografia corrispondente per implementare la raccolta dei campioni, l'elaborazione dei dati e il reporting dei risultati

PARTE
05 Individuazione dei picchi quantitativi (qualitativi)

Identificare qualitativamente ciascun picco cromatografico da quantificare

Innanzitutto, utilizzare il campione standard per determinare il tempo di ritenzione (Rt) del picco cromatografico da quantificare.Confrontando il tempo di ritenzione, trovare il componente corrispondente a ciascun picco cromatografico nel campione sconosciuto.Il metodo qualitativo cromatografico consiste nel confrontare il tempo di ritenzione con il campione standard.Il criterio Insufficienteulteriore conferma (qualitativa)

1. Metodo dell'aggiunta standard

2. Utilizzare altri metodi contemporaneamente: altri metodi cromatografici (modificare il meccanismo, ad esempio: utilizzo di colonne cromatografiche diverse), altri rilevatori (PDA: confronto dello spettro, ricerca nella libreria degli spettri; MS: analisi dello spettro di massa, ricerca nella libreria degli spettri)

3. Altri strumenti e metodi

PARTE
06 Conferma della consistenza quantitativa del picco

Confermare la consistenza del picco cromatografico (purezza)

Assicurarsi che vi sia un solo componente misurato sotto ciascun picco cromatografico

Verifica interferenze da sostanze coeluenti (impurità)

Metodi per la conferma della consistenza dei picchi cromatografici (purezza)

Confronto degli spettrogrammi con i rilevatori a matrice di fotodiodi (PDA).

Identificazione della purezza dei picchi

2996 Teoria dell'angolo di purezza

Metodi quantitativi comunemente utilizzati nella PARTE 07

Metodo della curva standard, suddiviso in metodo dello standard esterno e metodo dello standard interno:

1. Metodo standard esterno: più utilizzato nella cromatografia liquida

Una serie di campioni standard di concentrazioni note è stata preparata utilizzando campioni puri dei composti da testare come campioni standard.iniettato nella colonna fino al suo valore di risposta (area del picco).
Entro un certo intervallo, esiste una buona relazione lineare tra la concentrazione del campione standard e il valore di risposta, ovvero W= f×A, e viene creata una curva standard.

Nelle stesse identiche condizioni sperimentali, iniettare il campione sconosciuto per ottenere il valore di risposta del componente da misurare.In base al noto coefficiente f si può ottenere la concentrazione del componente da misurare.

I vantaggi del metodo standard esterno:funzionamento e calcolo semplici, è un metodo quantitativo comunemente usato;non è necessario che ciascun componente venga rilevato ed eluito;è richiesto un campione standard;le condizioni di misurazione del campione standard e del campione sconosciuto dovrebbero essere coerenti;il volume di iniezione dovrebbe essere preciso.

Svantaggi del metodo standard esterno:Le condizioni sperimentali devono essere elevate, ad esempio la sensibilità del rivelatore, la portata e la composizione della fase mobile non possono essere modificate;il volume di ciascuna iniezione dovrebbe avere una buona ripetibilità.

2. Metodo standard interno: accurato, ma problematico, più utilizzato nei metodi standard

Una quantità nota dello standard interno viene aggiunta allo standard per creare uno standard misto e vengono preparati una serie di standard di lavoro di concentrazione nota.Il rapporto molare tra standard e standard interno nello standard misto rimane invariato.Iniettare nella colonna cromatografica e assumere (area del picco del campione standard/area del picco del campione standard interno) come valore di risposta.In base alla relazione lineare tra il valore di risposta e la concentrazione dello standard di lavoro, ovvero W= f×A, viene creata una curva standard.

Una quantità nota di standard interno viene aggiunta al campione sconosciuto e iniettata nella colonna per ottenere il valore di risposta del componente da misurare.In base al noto coefficiente f si può ottenere la concentrazione del componente da misurare.

Le caratteristiche del metodo standard interno:Durante l'operazione, il campione e lo standard interno vengono miscelati insieme e iniettati nella colonna cromatografica, quindi finché il rapporto tra la quantità del componente misurato e lo standard interno nella soluzione miscelata è costante, la variazione del volume del campione non influenzerà i risultati quantitativi..Il metodo dello standard interno compensa l'influenza del volume del campione e anche della fase mobile e del rivelatore, pertanto è più accurato del metodo dello standard esterno.

PARTE
08 Fattori che influenzano i risultati dell'analisi quantitativa

Una scarsa precisione può essere causata da:

Integrazione errata dell'area del picco, decomposizione del campione o impurità introdotte durante la preparazione del campione, fiala del campione non sigillata, volatilizzazione del campione o del solvente, preparazione errata del campione, problemi di iniezione del campione, preparazione errata dello standard interno

Possibili ragioni per scarsa precisione:

Integrazione errata dei picchi, problemi di iniezione o iniettore, decomposizione del campione o impurità introdotte durante la preparazione del campione, problemi cromatografici, risposta degradata del rivelatore