la cromatografia, nota anche come "analisi cromatografica", "cromatografia", è un metodo di separazione e analisi, che ha una gamma molto ampia di applicazioni in chimica analitica, chimica organica, biochimica e altri campi.
Il fondatore della cromatografia è un botanico russo M.Tsvetter.Nel 1906 il botanico russo Zvetter pubblicò i risultati del suo esperimento: per separare i pigmenti vegetali, versò un estratto di etere di petrolio contenente pigmenti vegetali in un tubo di vetro contenente polvere di carbonato di calcio e lo eluì con etere di petrolio dall'alto verso il basso.Poiché diversi pigmenti hanno diverse capacità di adsorbimento sulla superficie delle particelle di carbonato di calcio, con il processo di lisciviazione, diversi pigmenti scendono a velocità diverse, formando così bande di diversi colori.I componenti del pigmento sono stati separati.Chiamò questo metodo di separazione cromatografia.
Rappresentazione schematica di un esperimento di separazione dei pigmenti delle foglie di una pianta
Con il continuo sviluppo dei metodi di separazione, sempre più sostanze incolori diventano oggetto di separazione, anche la cromatografia ha perso gradualmente il significato di "colore", ma il nome è in uso ancora oggi.
Classificazione cromatografica
L'essenza della cromatografia è un processo in cui le molecole da separare vengono ripartite ed equilibrate tra la fase stazionaria e la fase mobile.Sostanze diverse sono ripartite in modo diverso tra le due fasi, il che le fa muovere a velocità diverse con la fase mobile.Con il movimento della fase mobile, i diversi componenti della miscela vengono separati gli uni dagli altri nella fase stazionaria.A seconda del meccanismo, può essere suddiviso in diverse categorie.
1, secondo la classificazione dello stato fisico in due fasi
Fase mobile: Gascromatografia, cromatografia liquida, cromatografia fluida supercritica
Fase stazionaria: gas-solida, gas-liquida;Liquido-solido, liquido-liquido
2, secondo la forma di classificazione della fase stazionaria
Cromatografia su colonna: cromatografia su colonna impaccata, cromatografia su colonna capillare, cromatografia su colonna microimpaccata, cromatografia preparativa
Cromatografia piana: cromatografia su carta, cromatografia su strato sottile, cromatografia su membrana polimerica
3, classificati secondo il meccanismo della separazione
Cromatografia ad adsorbimento: i diversi componenti vengono separati in base alle loro capacità di adsorbimento e desorbimento sugli adsorbenti
Cromatografia di partizione: i diversi componenti vengono separati in base alla loro solubilità nel solvente
Cromatografia ad esclusione molecolare: in base alla dimensione molecolare della separazione Cromatografia a scambio ionico: diversi componenti dell'affinità per la separazione tramite resina a scambio ionico
Cromatografia di affinità: Separazione utilizzando la presenza di un'affinità specifica tra macromolecole biologiche
Elettroforesi capillare: i componenti sono stati separati in base alle differenze di mobilità e/o comportamento di partizione
La cromatografia chirale viene utilizzata per la separazione e l'analisi di farmaci chirali, che possono essere suddivisi in tre categorie: metodo del reagente di derivatizzazione chirale;Metodo additivo chirale della fase mobile;Metodo di risoluzione della fase stazionaria chirale
Terminologia di base per la cromatografia
Le curve ottenute tracciando i segnali di risposta dei componenti dopo il rilevamento della separazione cromatografica in funzione del tempo sono chiamate cromatogrammi.
Riferimento:In determinate condizioni cromatografiche, la curva del segnale generato quando solo la fase mobile passa attraverso il sistema di rilevamento è chiamata linea di base, come mostrato nella linea ot.Quando la condizione sperimentale era stabile, la linea di base era una linea parallela all'asse orizzontale.La linea di base riflette il rumore dello strumento, principalmente del rilevatore, nel tempo.
Altezza del picco:la distanza verticale tra il punto di picco cromatografico e la linea di base, indicata con h, come mostrato nella linea AB '.
Larghezza della regione:L'ampiezza della regione del picco cromatografico è direttamente correlata all'efficienza di separazione.Esistono tre metodi per descrivere l'ampiezza del picco cromatografico: deviazione standard σ, larghezza del picco W e FWHM W1/2.
Deviazione standard (σ):σ è la metà della distanza tra i due punti di flesso sulla curva di distribuzione normale e il valore di σ indica il grado di dispersione dei componenti lontano dalla colonna.Maggiore è il valore di σ, più dispersi saranno i componenti dell'effluente e peggiore sarà l'effetto di separazione.Al contrario, i componenti dell'effluente sono concentrati e l'effetto di separazione è buono.
Larghezza del picco W:I punti di intersezione su entrambi i lati del picco cromatografico vengono utilizzati come linee tangenti e l'intercetta sulla linea di base è chiamata larghezza del picco o larghezza della linea di base, che può anche essere espressa come W, come mostrato nella Figura IJ.Secondo il principio della distribuzione normale, si può dimostrare che la relazione tra l'ampiezza del picco e la deviazione standard è W=4σ.
W1/2:L'ampiezza del picco a metà dell'altezza del picco è chiamata FWHM, come mostrato per la distanza di GH.W1/2=2.355σ, W=1.699W1/2.
W1/2, W derivano entrambi da σ e vengono utilizzati per calcolare le aree dei picchi oltre a misurare l'effetto colonna.La misurazione FWHM è più conveniente e più comunemente utilizzata.
breve riassunto
Dalla curva di deflusso del picco cromatografico si possono raggiungere i seguenti obiettivi:
a. L'analisi qualitativa è stata eseguita in base al valore di ritenzione dei picchi cromatografici
b, analisi quantitativa basata sull'area o picco del picco cromatografico
C. L'efficienza di separazione della colonna è stata valutata in base al valore di ritenzione e all'ampiezza del picco cromatografico
La formula di calcolo coinvolta nella cromatografia
1. Valore di ritenzione
Il valore di ritenzione è un parametro utilizzato per descrivere il grado in cui un componente del campione viene trattenuto nella colonna e viene utilizzato come indicatore della caratterizzazione cromatografica.Il suo metodo di rappresentazione è il seguente:
Tempo di ritenzione tR
Ora della mortetM
Regolare il tempo di ritenzione tR'=tR-tM
(Tempo totale trascorso in fase stazionaria)
Volume di ritenzione
VR=tR*F.(indipendente dalla velocità della fase mobile)
Volume morto
VM=tM*Fc
(Lo spazio non occupato dalla fase stazionaria nel percorso del flusso dall'iniettore al rilevatore)
Regolare il volume di ritenzione VR'=t'R*Fc
2. Valore di ritenzione relativo
Il valore di ritenzione relativa, noto anche come fattore di separazione, rapporto del coefficiente di partizione o fattore di capacità relativa, è il rapporto tra il tempo di ritenzione (volume) regolato del componente testato e il tempo di ritenzione (volume) regolato dello standard in determinate condizioni cromatografiche.
I valori di ritenzione relativi sono stati utilizzati per eliminare l'influenza di determinate condizioni operative, come la portata e la perdita di fissativo, sui valori di ritenzione.Lo standard nel valore di ritenzione relativo può essere un componente del campione testato o un composto aggiunto artificialmente.
3. Indice di ritenzione
L'indice di ritenzione è l'indice di ritenzione della sostanza i da testare in una soluzione fissa X. Come sostanze di riferimento vengono selezionati due n-alani, uno dei quali ha numero di carbonio N e l'altro ha N+n.Il loro tempo di ritenzione regolato è rispettivamente t 'r (N) e t 'r (N+n), in modo che il tempo di ritenzione regolato t 'r (i) della sostanza i da testare sia esattamente compreso tra loro, cioè: t'r (N).
L'indice di ritenzione può essere calcolato come segue.
4. Fattore di capacità (k)
All'equilibrio, il rapporto tra la massa di un componente nella fase stazionaria (s) e quella mobile (m), chiamato fattore di capacità.La formula è la seguente:
5、Coefficiente di partizione (K) In equilibrio, il rapporto tra la concentrazione di un componente nella fase stazionaria (s) e quella mobile (m), chiamato coefficiente di partizione.La formula è la seguente
La relazione tra K e k:
Riflette il tipo di colonna e il suo nodo, importanti proprietà della struttura
breve riassunto
Relazione tra valore di ritenzione e fattore di capacità e coefficiente di ripartizione:
La separazione cromatografica si basa sulla differenza nella capacità di adsorbimento o dissoluzione di ciascun componente in un campione relativo fisso, che può essere espressa quantitativamente dalla dimensione del valore del coefficiente di ripartizione K (o fattore di capacità k).
I componenti con forte capacità di adsorbimento o dissoluzione hanno un grande coefficiente di ripartizione (o fattore di capacità) e un lungo tempo di ritenzione.Al contrario, i componenti con debole adsorbimento o solubilità hanno un piccolo coefficiente di ripartizione e un breve tempo di ritenzione.
Teoria di base della cromatografia
1. Teoria del vassoio
(1) Proposta: teoria termodinamica
Tutto è iniziato con il modello di piastra a torre proposto da Martin e Synge.
Colonna di frazionamento: nel vassoio per più tempi di equilibrio gas-liquido, a seconda del punto di ebollizione delle diverse separazioni.
Colonna: I componenti sono bilanciati da ripartizioni multiple tra le due fasi e separati secondo diversi coefficienti di ripartizione.
(2) Ipotesi
(1) Ci sono molti piatti nella colonna e i componenti possono raggiungere rapidamente l'equilibrio di distribuzione all'interno dell'intervallo dei piatti (ovvero l'altezza del piatto).
(2) La fase mobile entra nella colonna, non in modo continuo ma pulsante, cioè ogni passaggio è un volume della colonna.
(3) Quando il campione veniva aggiunto a ciascuna piastra della colonna, la diffusione del campione lungo l'asse della colonna poteva essere trascurata.
(4) Il coefficiente di ripartizione è uguale su tutti i vassoi, indipendentemente dalla quantità di componenti.Cioè, il coefficiente di ripartizione è costante su ciascun taban.
(3) Principio
Diagramma schematico della teoria del vassoio
Se un componente di unità di massa, vale a dire m=1 (ad esempio, 1 mg o 1μg), viene aggiunto al vassoio n. 0, e dopo l'equilibrio della distribuzione, poiché k=1, vale a dire ns=nm, nm=ns=0,5.
Quando un volume della piastra (lΔV) di gas di trasporto entra nella piastra 0 sotto forma di pulsazione, il gas di trasporto contenente il componente nm nella fase gassosa viene spinto verso la piastra 1. In questo momento, il componente ns nella fase liquida della piastra 0 e la componente nm nella fase gassosa della piastra 1 verrà ridistribuita tra le due fasi.Pertanto, la quantità totale di componenti contenuti nella piastra 0 è 0,5, in cui le fasi gassosa e liquida sono ciascuna 0,25, e anche la quantità totale contenuta nella piastra 1 è 0,5.Anche le fasi gassosa e liquida erano 0,25.
Questo processo viene ripetuto ogni volta che un nuovo gas di trasporto del volume della piastra viene pulsato nella colonna (vedere la tabella seguente).
(4) Equazione della curva di deflusso cromatografica
σ è la deviazione standard, è il tempo di ritenzione, C è la concentrazione in qualsiasi momento,
C, è la concentrazione di iniezione, ovvero la quantità totale di componenti (area del picco A).
(5) parametri di efficienza della colonna
A tR costante, minore è W o w 1/2 (ovvero, il picco più stretto), maggiore è il numero di piastre teoriche n, minore è l'altezza teorica delle piastre e maggiore è l'efficienza di separazione della colonna.Lo stesso vale per la teoria efficace Tray Neff.Pertanto il numero teorico di piatti è un indice per valutare l'efficienza delle colonne.
(5)Caratteristiche e carenze
> Vantaggi
La teoria del vassoio è semi-empirica e spiega la forma della curva di deflusso
Vengono illustrati i processi di partizionamento e separazione dei componenti
Viene proposto un indice per valutare l'efficienza della colonna
> Limitazioni
I componenti non possono realmente raggiungere l’equilibrio distributivo nelle due fasi:
La diffusione longitudinale dei componenti nella colonna non può essere ignorata:
Non è stata considerata l'influenza di vari fattori cinetici sul processo di trasferimento di massa.
La relazione tra effetto colonna e velocità del flusso della fase mobile non può essere spiegata:
Non è chiaro quali siano i principali fattori che influenzano l’effetto colonna
Questi problemi sono risolti in modo soddisfacente nella teoria dei tassi.
2. Teoria dei tassi
Nel 1956, lo studioso olandese VanDeemter et al.assorbì il concetto di teoria del vassoio e combinò i fattori cinetici che influenzano l'altezza del vassoio, avanzò la teoria cinetica del processo cromatografico - teoria della velocità e derivò l'equazione di VanDeemter.Considera il processo cromatografico come un processo dinamico di non equilibrio e studia l'influenza dei fattori cinetici sull'allargamento del picco (cioè l'effetto colonna).
Successivamente, Giddings e Snyder et al.propose l'equazione della velocità della cromatografia liquida (ovvero l'equazione di Giddings) basata sull'equazione di VanDeemter (in seguito chiamata equazione della velocità della gascromatografia) e in base alla differenza di proprietà tra liquido e gas.
(1) Equazione di Van Deemter
Dove: H: è l'altezza della tavola
A: coefficiente del termine di diffusione vorticosa
B: coefficiente del termine di diffusione molecolare
C: coefficiente del termine di resistenza al trasferimento di massa
(2) Equazione di Giddings
Analisi quantitativa e qualitativa
(1) Analisi qualitativa
L'analisi cromatografica qualitativa consiste nel determinare i composti rappresentati da ciascun picco cromatografico.Poiché varie sostanze hanno valori di ritenzione definiti in determinate condizioni cromatografiche, il valore di ritenzione può essere utilizzato come indice qualitativo.Attualmente diversi metodi qualitativi cromatografici si basano sui valori di ritenzione.
Tuttavia, sostanze diverse possono avere valori di ritenzione simili o identici nelle stesse condizioni cromatografiche, ovvero i valori di ritenzione non sono esclusivi.Pertanto è difficile caratterizzare un campione completamente sconosciuto basandosi solo sui valori di ritenzione.Se sulla base della comprensione dell'origine, della natura e dello scopo del campione è possibile esprimere un giudizio preliminare sulla composizione del campione, è possibile utilizzare i seguenti metodi per determinare il composto rappresentato dal picco cromatografico.
1. Controllo qualitativo utilizzando sostanze pure
In determinate condizioni cromatografiche, una sostanza sconosciuta ha solo un tempo di ritenzione definito.Pertanto, la sostanza sconosciuta può essere identificata qualitativamente confrontando il tempo di ritenzione della sostanza pura nota nelle stesse condizioni cromatografiche con il tempo di ritenzione della sostanza sconosciuta.Se le due sono la stessa cosa, la sostanza sconosciuta può essere una sostanza pura conosciuta;Altrimenti l'ignoto non è la sostanza pura.
Il metodo di controllo della sostanza pura è applicabile solo alla sostanza sconosciuta la cui composizione è nota, la cui composizione è relativamente semplice e la cui sostanza pura è nota.
2. Metodo del valore di conservazione relativo
Il valore di ritenzione relativo α, si riferisce all'adattamento tra il componente i e i materiali di riferimento Rapporto dei valori di ritenzione:
Cambia solo con il cambiamento del fissativo e della temperatura della colonna e non ha nulla a che fare con altre condizioni operative.
Ad una determinata fase stazionaria e temperatura della colonna, i valori di ritenzione regolati del componente i e della sostanza di riferimento s vengono misurati rispettivamente e quindi calcolati secondo la formula precedente.I valori di ritenzione relativa ottenuti possono essere confrontati qualitativamente con i corrispondenti valori presenti in letteratura.
3, aggiungendo sostanze note per aumentare il metodo dell'altezza del picco
Quando sono presenti molti componenti nel campione sconosciuto, i picchi cromatografici ottenuti sono troppo densi per essere facilmente identificati con il metodo sopra descritto o quando il campione sconosciuto viene utilizzato solo per l'analisi dell'elemento specificato.
"Prima viene realizzato un cromatogramma di un campione sconosciuto, quindi si ottiene un ulteriore cromatogramma aggiungendo una sostanza nota al campione sconosciuto."Per tali sostanze sono noti componenti con altezze dei picchi maggiori.
4. Mantenere il metodo qualitativo dell'indice
L'indice di ritenzione rappresenta il comportamento di ritenzione delle sostanze sui fissativi ed è attualmente l'indice qualitativo più utilizzato e riconosciuto a livello internazionale in GC.Presenta i vantaggi di una buona riproducibilità, di uno standard uniforme e di un piccolo coefficiente di temperatura.
L'indice di ritenzione è legato solo alle proprietà della fase stazionaria e alla temperatura della colonna, ma non ad altre condizioni sperimentali.La sua precisione e riproducibilità sono eccellenti.Finché la temperatura della colonna è la stessa della fase stazionaria, per l'identificazione è possibile applicare il valore riportato in letteratura e non è necessario utilizzare il materiale puro per il confronto.
(2)Analisi quantitativa
Base per la quantificazione cromatografica:
Il compito dell'analisi quantitativa è trovare il centinaio di componenti nel campione misto
Contenuto frazionario.La quantificazione cromatografica si basava su quanto segue: quando le condizioni operative erano coerenti, era
La massa (o concentrazione) del componente misurato è determinata dal segnale di risposta fornito dal rilevatore
È proporzionale.Vale a dire:
Base per la quantificazione cromatografica:
Il compito dell'analisi quantitativa è trovare il centinaio di componenti nel campione misto
Contenuto frazionario.La quantificazione cromatografica si basava su quanto segue: quando le condizioni operative erano coerenti, era
La massa (o concentrazione) del componente misurato è determinata dal segnale di risposta fornito dal rilevatore
È proporzionale.Vale a dire:
1. Metodo di misurazione dell'area del picco
L'area del picco rappresenta i dati quantitativi di base forniti dai cromatogrammi e la precisione della misurazione dell'area del picco influisce direttamente sui risultati quantitativi.Sono stati utilizzati metodi di misurazione diversi per picchi cromatografici con forme di picco diverse.
È difficile trovare il valore esatto dell’inverno nell’analisi quantitativa:
Da un lato per la difficoltà di misurare con precisione il volume assoluto di iniezione: dall'altro
L'area del picco dipende dalle condizioni cromatografiche e la striscia cromatografica deve essere mantenuta quando viene misurato il valore
Non è né possibile né conveniente fare la stessa cosa.E anche se riesci a farlo bene
Il valore esatto, anche perché non esiste uno standard unificato e non può essere applicato direttamente.
2.Fattore di correzione quantitativo
Definizione del fattore di correzione quantitativo: quantità di componenti che entrano nel rilevatore (m)
Il rapporto tra l'area del picco cromatografico (A) o l'altezza del picco () è una costante di proporzionalità (,
La costante di proporzionalità è chiamata fattore di correzione assoluto per il componente.
È difficile trovare il valore esatto dell’inverno nell’analisi quantitativa:
Da un lato per la difficoltà di misurare con precisione il volume assoluto di iniezione: dall'altro
L'area del picco dipende dalle condizioni cromatografiche e la striscia cromatografica deve essere mantenuta quando viene misurato il valore
Non è né possibile né conveniente fare la stessa cosa.E anche se riesci a farlo bene
Il valore esatto, anche perché non esiste uno standard unificato e non può essere applicato direttamente.
Cioè, il fattore di correzione relativo di un componente è il componente e il materiale di riferimento
Il rapporto dei fattori di correzione assoluti.
Si può vedere che il fattore di correzione relativo è quando la qualità del componente rispetto allo standard.
Quando la sostanza s è uguale, l'area del picco del materiale di riferimento è l'area del picco del componente
Molteplici.Se qualche componente ha massa m e area di picco A, allora il numero di f'A
I valori sono uguali all'area del picco del materiale di riferimento con massa di.In altre parole,
Attraverso il relativo fattore di correzione è possibile separare le aree dei picchi di ciascun componente
Convertito nell'area del picco del materiale di riferimento pari alla sua massa, quindi nel rapporto
Lo standard è unificato.Quindi questo è il metodo normalizzato per calcolare la percentuale di ciascun componente
La base della quantità.
Metodo per ottenere il fattore di correzione relativo: i valori del fattore di correzione relativo sono stati confrontati solo con l'essere
La misurazione non è legata allo standard e al tipo di rilevatore, ma alla striscia operativa
Non importa.Pertanto, i valori possono essere recuperati dai riferimenti in letteratura.Se il testo
Se non riesci a trovare il valore desiderato nell'offerta, puoi anche determinarlo da solo.Metodo di determinazione
Metodo: una certa quantità della sostanza misurata, dieci materiali di riferimento selezionati → trasformata in una determinata concentrazione
Sono state misurate le aree dei picchi cromatografici A e As dei due componenti.
Questa è la formula.
3. Metodo di calcolo quantitativo
(1) Metodo di normalizzazione dell'area
La somma del contenuto di tutte le frazioni prive di picchi è stata calcolata come 100% per la quantificazione
Il metodo si chiama normalizzazione.La sua formula di calcolo è la seguente:
Dove P,% è il contenuto percentuale dei componenti testati;A1, A2... A n è il componente 1. L'area del picco di 1~n;f'1, f'2... f'n è il fattore di correzione relativo per i componenti da 1 a n.
(2) metodo standard esterno
Il metodo di confronto quantitativo tra il segnale di risposta del componente da testare nel campione e il componente puro da testare come controllo.
(3) Metodo standard interno
Il cosiddetto metodo dello standard interno è un metodo in cui una certa quantità di sostanza pura viene aggiunta alla soluzione standard della sostanza testata e alla soluzione campione come standard interno, quindi analizzata e determinata.
(3)metodo di aggiunta standard
Il metodo dell'addizione standard, noto anche come metodo dell'addizione interna, consiste nell'aggiungere una certa quantità di (△C)
Il riferimento della sostanza in esame è stato aggiunto alla soluzione campione da testare e il test è stato aggiunto al dosaggio
Il picco della soluzione campione dopo la sostanza era superiore a quello della soluzione campione originale
L'incremento dell'area (△A) è stato utilizzato per calcolare la concentrazione della sostanza nella soluzione campione
Contenuto (Cx)
Dove Ax è l'area del picco della sostanza da misurare nel campione originale.
Orario di pubblicazione: 27 marzo 2023